Direct Gene Transfer

A. Direct Gene Transfer

In addition to Agrobacterium-mediated gene transfer, several artificial methods have been developed for plant transgenesis. These rely on the direct transfer of large amounts of naked DNA during transient permeabilization of plant cells. Several agents and strategies are available to achieve this transient permeability of the cells: chemicals, electric fields and bombardment of plant tissues with high- velocity particles. These methods can be used to deliver transgenes not only to the nuclear genome but also to the genome of chloroplasts.

E. Direct Gene transfer

Selain transfer gen Agrobacterium-dimediasi, beberapa metode buatan telah dikembangkan untuk transgenesis tanaman. Ini bergantung pada transfer langsung dalam jumlah besar DNA telanjang selama Permeabilisasi sementara sel tumbuhan. Beberapa agen dan strategi yang tersedia untuk mencapai permeabilitas ini sementara sel: bahan kimia, listrik dan pemboman jaringan tanaman dengan partikel kecepatan tinggi. Metode ini dapat digunakan untuk memberikan transgen tidak hanya untuk genom nuklir tetapi juga untuk genom kloroplas.
PEG-mediated transformation (Chemical Technique)

Chemicals can be used to disrupt transiently the plasma membrane of plant cells. This method requires direct access of the transforming DNA through the plasma membrane to cells deprived of their cell wall: protoplasts. The protoplasts are subjected to treatment with polyethylene glycol (PEG) and bivalent cations (calcium or magnesium) in the presence of naked transforming DNA. PEG and the cations compact DNA, destabilize the plasma membrane, and render it transiently permeable to DNA. Once in the cell, DNA enters the nucleus, possibly while the nuclear envelope is disrupted during cell division, and integrates randomly into the plant genome.

a. Transformasi PEG-dimediasi (Kimia Teknik)

Bahan kimia dapat digunakan untuk mengganggu secara sementara membran plasma sel tumbuhan. Metode ini memerlukan akses langsung dari DNA mengubah melalui membran plasma sel kehilangan dinding sel mereka: protoplas. Protoplas dikenakan pengobatan dengan polietilen glikol (PEG) dan kation bivalen (kalsium atau magnesium) di hadapan DNA transformasi telanjang. PEG dan kation DNA kompak, mengacaukan membran plasma, dan membuat itu secara sementara permeabel untuk DNA. Setelah di dalam sel, DNA memasuki inti, mungkin sementara amplop nuklir terganggu selama pembelahan sel, dan terintegrasi secara acak ke dalam genom tanaman.

In the PEG-mediated transformation procedure, the cells that are competent for transformation receive large amounts of DNA. Prior to, or concomitant to, their integration into the plant genome the different DNA molecules can recombine. In addition, the transforming DNA is easily accessible to DNA-degrading enzymes, a process that frequently leads to truncated versions of the transgene. These complex integrated units may be unstable and part of the transgenes may be lost upon recombination between the long stretches of identical sequences. In addition, gene expression from complex loci may be silenced (see below).

Dalam prosedur transformasi PEG-dimediasi, sel-sel yang kompeten untuk transformasi menerima sejumlah besar DNA. Sebelum, atau bersamaan dengan, integrasi mereka ke dalam genom tanaman molekul DNA yang berbeda dapat bergabung kembali. Selain itu, DNA mengubah mudah diakses untuk enzim DNA-merendahkan, sebuah proses yang sering mengarah ke versi terpotong transgen. Unit-unit yang terintegrasi kompleks mungkin tidak stabil dan bagian dari transgen mungkin akan hilang pada rekombinasi antara membentang panjang urutan identik. Selain itu, ekspresi gen dari lokus yang kompleks dapat dibungkam.

The fact that protoplasts are used for PEG-mediated transformation is both an advantage and a disadvantage. Protoplasts can be easily obtained from a wide range of plant material. Millions of them can be handled and transformed simultaneously, leading to the production of hundreds, or even thousands, of transformants. However, the generation of fertile transgenic plants by this technique depends on the availability of a protoplast-to-plant regeneration procedure, the efficiency of which is greatly dependent on the plant used.

Fakta bahwa protoplas digunakan untuk transformasi PEG-dimediasi adalah baik keuntungan dan kerugian. Protoplas dapat dengan mudah diperoleh dari berbagai bahan tanaman. Jutaan dari mereka dapat ditangani dan diubah secara bersamaan, yang mengarah ke produksi ratusan, atau bahkan ribuan, dari transforman. Namun, generasi tanaman transgenik yang subur dengan teknik ini tergantung pada ketersediaan prosedur regenerasi protoplas-to-tanaman, efisiensi yang sangat bergantung pada tanaman yang digunakan.
Micro-projectile bombardment

This technique uses high velocity particles, or micro-projectiles, that are coated with DNA and deliver exogenous genetic material into the target cell or tissue. Transformed cells are selected, cultured in vitro and regenerated to produce mature transformed plants (Kikkert et al., 2005). Micro-projectile bombardment is plant cell transformation by shooting DNA-coated micro-particles into plant material.

b. mikroproyektil pemboman

Teknik ini menggunakan partikel tinggi kecepatan, atau mikro-proyektil, yang dilapisi dengan DNA dan menyampaikan materi genetik eksogen ke dalam sel target atau jaringan. Sel berubah dipilih, berbudaya in vitro dan regenerasi untuk menghasilkan tanaman dewasa berubah. Micro-proyektil penembakan adalah sel transformasi tanaman dengan menembak mikro-partikel berlapis-DNA ke dalam bahan tanaman.

The particles, either tungsten or gold, are small (0.5-5 μm) but big enough to have the necessary mass to be sufficiently accelerated and penetrate the cell wall carrying the coated DNA on their surface. Once the foreign DNA is integrated into the plant genome in the cell nucleus, which is a somewhat spontaneous process, it can be expressed. Gold particles are chemically inert, although rather costly, and show a high uniformity. Tungsten particles, despite showing mild phytotoxicity and being more variable in size, are adequate for most studies. Furthermore, the chosen micro-projectile should have good DNA binding affinity but, at the same time, be able to release the DNA once it has hit the target. DNA coating of surface-sterilized particles can be accomplished by defined DNA treatments using, for instance, the calcium chloride method, with the addition of certain chemicals to protect the DNA. However, a recent report describes the novel use of Agrobacterium as coating material for the micro-projectiles, which are then shot into the target tissue. Once coated the particles are ready for shooting; the particles are accelerated and ultimatively collide with the target, usually plant cells or calli grown on a Petri dish. The DNA, delivered with this strategy, is expressed after reaching the nucleus and integrating randomly into the plant genome.

Partikel, baik tungsten atau emas, kecil (0,5-5 m) tapi cukup besar untuk memiliki diperlukan massa yang akan cukup dipercepat dan menembus dinding sel yang membawa DNA dilapisi pada permukaan mereka. Setelah DNA asing diintegrasikan ke dalam genom tanaman dalam inti sel, yang merupakan proses yang agak spontan, dapat dinyatakan. Partikel emas secara kimiawi inert, meskipun agak mahal, dan menunjukkan keseragaman yang tinggi. Partikel tungsten, meskipun menunjukkan phytotoxicity ringan dan menjadi lebih bervariasi dalam ukuran, yang cukup untuk kebanyakan studi. Selain itu, mikro-proyektil yang dipilih harus memiliki afinitas pengikatan DNA baik tetapi, pada saat yang sama, dapat melepaskan DNA setelah telah mencapai target. Pelapisan DNA partikel permukaan disterilkan dapat dicapai dengan perawatan DNA didefinisikan menggunakan, misalnya, metode kalsium klorida, dengan penambahan bahan kimia tertentu untuk melindungi DNA. Namun, laporan terbaru menjelaskan penggunaan novel Agrobacterium sebagai bahan pelapis untuk mikro-proyektil, yang kemudian menembak ke jaringan target. Setelah dilapisi partikel siap untuk menembak; partikel dipercepat dan ultimatively bertabrakan dengan target, biasanya sel-sel tanaman atau kalus tumbuh pada cawan Petri. DNA, disampaikan dengan strategi ini, diungkapkan setelah mencapai inti dan mengintegrasikan secara acak ke dalam genom tanaman.
Electroporation

Electrical pulses are applied to the DNA-protoplast mixture, provoking an increase in the protoplast membrane permeability to DNA. This technique is much simpler than the chemical method, providing satisfying results. However, the electrical pulses must be carefully controlled as cell death can occur above a certain threshold. The pulses induce the transient formation of micropores in the membrane lipid bilayer which persist for a few minutes, allowing DNA uptake to occur.

c.elektroporasi

kejutan listrik dalam elektrik diterapkan pada campuran DNA-protoplas, memprovokasi peningkatan permeabilitas membran protoplas untuk DNA. Teknik ini jauh lebih sederhana daripada metode kimia, memberikan hasil yang memuaskan. Namun, kejutan elektrik harus hati-hati dikendalikan karena kematian sel dapat terjadi di atas ambang tertentu. Kejutan menginduksi pembentukan transien mikrospora dalam lipid bilayer membran yang bertahan selama beberapa menit, memungkinkan penyerapan DNA terjadi.
Micro-injection

This technique was originally designed to transform animal cells, and was later adapted for and gained importance in transforming plant cells. However, in plant cells the existence of a rigid cell wall, a natural barrier, prevents micro-injection. Furthermore, the presence of vacuoles that contain hydrolases and toxic metabolites that may lead to cell death after vacuole breakage presents a severe restriction to micro-injection. Therefore, protoplasts, rather than intact plant cells, are more suitable for micro-injection. This method is labour-intensive and requires special micro-equipment for the manipulation of host protoplasts and DNA. However, some success in transforming both monocotyledonous and dicotyledonous species has been achieved employing this technique.

a. Micro-injection

Teknik ini awalnya dirancang untuk mengubah sel-sel hewan, dan kemudian diadaptasi untuk dan memperoleh penting dalam mengubah sel-sel tumbuhan. Namun, dalam sel-sel tanaman keberadaan dinding sel yang kaku, penghalang alami, mencegah mikro-injeksi. Selain itu, kehadiran vakuola yang mengandung hidrolase dan metabolit beracun yang dapat menyebabkan kematian sel setelah vakuola kerusakan menyajikan pembatasan parah mikro-injeksi. Oleh karena itu, protoplas, bukan sel tanaman utuh, lebih cocok untuk mikro-injeksi. Metode ini padat karya dan membutuhkan mikro-peralatan khusus untuk manipulasi protoplas host dan DNA. Namun, beberapa keberhasilan dalam mengubah spesies baik monokotil dan dikotil telah dicapai menggunakan teknik ini.

b. Virus-mediated plant transformation/transduction

Virus-based vectors have been shown to be efficient tools for the transient, highlevel expression of foreign proteins in plants. These vectors are derived from plant viruses, e.g. Tobacco Mosaic Virus (TMV), and are manipulated to encode a protein of interest. Initial delivery of the virus-based vector to the plant can be achieved by Agrobacterium- the vector is encoded in the T-DNA, which is transferred to the plant. This method is applicable to whole plants, by the process of agroinfiltration, circumventing the need for labour-intensive tissue-culture.

e. Virus-dimediasi transformasi tanaman / transduksi

Vektor-virus berbasis telah terbukti menjadi alat yang efisien untuk sementara, ekspresi tingkat tinggi protein asing dalam tanaman. Vektor ini berasal dari virus tanaman, misalnya Tembakau Mosaic Virus (TMV), dan dimanipulasi untuk mengkodekan protein yang menarik. Pengiriman awal dari vektor berbasis virus pada tanaman dapat dicapai dengan Agrobacterium- vektor dikodekan dalam T-DNA, yang ditransfer ke tanaman. Metode ini berlaku untuk seluruh tanaman, dengan proses agroinfiltration, menghindari kebutuhan untuk padat karya jaringan-budaya.

Within a plant cell, the virus-based vectors are autonomously replicated, can spread from cell to cell and direct the synthesis of the encoded protein of interest. The advantages of this method are the applicability to whole plants and thus a much faster outcome than the establishment of a transgenic plant, and the high-level expression of the desired protein within a short time. The major disadvantage is that the process is transient: the expression level decreases over time, and the genetic change is not passed on to subsequent generations, i.e. it is not heritable. The process of virus-mediated DNA transfer is referred to as transduction.

Dalam sel tumbuhan, vektor berbasis virus yang mandiri direplikasi, dapat menyebar dari sel ke sel dan mengarahkan sintesis protein dikodekan bunga. Keuntungan dari metode ini adalah penerapan untuk seluruh tanaman dan dengan demikian hasil yang jauh lebih cepat dari pembentukan tanaman transgenik, dan ekspresi tingkat tinggi protein yang diinginkan dalam waktu singkat. Kerugian utama adalah bahwa proses ini sementara: tingkat ekspresi menurun dari waktu ke waktu, dan perubahan genetik tidak diwariskan kepada generasi berikutnya, yaitu tidak diwariskan. Proses transfer DNA virus-dimediasi disebut sebagai transduksi.

Several other plant transformation techniques, which have been reported but could not be reproduced or did not gain significant importance, are listed below in Table 4.2:

Post a Comment

Artikel Terkait Tips Motivasi