C. Prosedur Membuat transgenik Tanaman
Sejak laporan pertama tentang tanaman transgenik pada tahun 1983, transformasi tanaman dengan gen asing telah menjadi fitur kunci dalam pengembangan biologi tanaman modern. Tanaman transgenik, selain nilai mereka untuk perbaikan tanaman, menyediakan alat yang sangat diperlukan untuk analisis fungsi dan regulasi gen tanaman. Selain itu, studi tentang proses transformasi telah memainkan peran kunci dalam pengembangan biologi molekuler tanaman. Metode yang berbeda telah dikembangkan untuk memperkenalkan gen asing ke dalam tanaman. Sebuah fitur umum adalah bahwa DNA transformasi harus melewati hambatan membran yang berbeda; memiliki pertama yang masuk ke dalam sel tanaman dengan menembus dinding sel tanaman dan membran plasma; maka harus lulus nuklir / penghalang sitoplasma. Akhirnya, segmen DNA yang baru diperkenalkan harus membangun dirinya dalam genom tanaman. Setelah ini tercapai, peristiwa transformasi dapat dipilih untuk dan, jika kompetensi regenerasi tumpang tindih dengan kompetensi transformasi, tanaman transgenik dapat diregenerasi.
The most widely used techniques are the Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer, micro-projectile bombardment (“gene gun” or biolistic method) and direct gene transfer to protoplasts. The biolistic technique has proven especially useful in transforming monocotyledonous species like maize and rice, whereas transformation via Agrobacterium has been successfully practised in dicotyledonous species. Only recently has it also been effectively employed in monocotyledons. In general, the Agrobacterium-mediated method is considered preferable to the gene gun due to the higher frequency of single-site insertions of the foreign DNA into the host genome, making the transformation process easier to monitor.
Yang paling banyak digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenic adalah teknik transfer yang menggunakan Agrobacterium tumefaciens-dimediasi, mikro-proyektil penembakan ("pistol gen" atau metode Biolistic) dan transfer gen langsung ke protoplas. Teknik Biolistic telah terbukti sangat berguna dalam mengubah spesies monokotil seperti jagung dan beras, sedangkan transformasi melalui Agrobacterium telah berhasil dilakukan pada spesies dikotil. Hanya baru-baru ini juga telah efektif digunakan dalam monokotil. Secara umum, metode Agrobacterium-dimediasi dianggap lebih baik untuk pistol gen karena frekuensi yang lebih tinggi dari sisipan tunggal situs dari DNA asing ke genom inang, membuat proses transformasi lebih mudah untuk memantau.
B. Agrobacterium-mediated Gene Transfer
Agrobacterium tumefaciens is a soil-borne bacterium that initiates the development of a crown gall tumour on susceptible plants. This disease is the result of a unique natural inter-kingdom gene transfer event. Within the last two decades, it has attracted much attention because of the mechanism of transfer itself, and its applicability to the generation of transgenic plants.
D.Agrobacterium-dimediasi Gene transfer
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah-ditanggung yang memulai pengembangan tumor mahkota empedu pada tanaman rentan. Penyakit ini merupakan hasil dari antar-kerajaan acara transfer gen alam yang unik. Dalam dua dekade terakhir, telah menarik banyak perhatian karena mekanisme transfer itu sendiri, dan penerapannya untuk generasi tanaman transgenik.
a. Agrobacterium tumefaciens and the Ti plasmid.
Tumours induced by Agrobacterium tumefaciens result from the transfer and stable integration into the plant genome of a piece of bacterial DNA, the T-DNA (transferred DNA). This first component consists of a Ti (tumour inducing) plasmid of 200 kilobases (kb) (or even larger), which encodes most of the enzymes and structural components required for tumour development. T-DNA genes are expressed in plant cells because of the eukaryotic expression signals they carry. Parts of them code for the synthesis of, or the sensitivity to, plant growth factors (called auxins and cytokinins) leading to the uncontrolled growth of the transformed plant cells. T-DNA also carries genes responsible for the synthesis of opines, which are low molecular mass compounds that agrobacteria use as carbon, nitrogen and energy sources. Transformation by the T-DNA results, therefore, in proliferation of plant cells that produce metabolites used preferentially by the inciting bacteria; it thus provides an ecological niche for Agrobacterium.
a. Agrobacterium tumefaciens dan plasmid Ti.
Tumor yang disebabkan oleh Agrobacterium tumefaciens hasil dari transfer dan integrasi stabil sepotong DNA bakteri, T-DNA (DNA ditransfer) ke dalam genom tanaman. Komponen pertama ini terdiri dari plasmid Ti (penstimulasi tumor) dari 200 kilobases (kb) (atau bahkan lebih besar), yang mengkode sebagian besar enzim dan komponen struktural yang diperlukan untuk perkembangan tumor. Gen T-DNA diekspresikan dalam sel-sel tanaman karena sinyal ekspresi eukariotik mereka bawa. Bagian dari mereka mengkode dalam proses sintesis, atau kepekaan terhadap, faktor pertumbuhan tanaman (disebut auksin dan sitokinin) yang mengarah ke pertumbuhan yang tidak terkendali dari sel-sel tanaman yang telah berubah. T-DNA juga membawa gen yang bertanggung jawab untuk sintesis opines, yang merupakan senyawa massa molekul rendah yang agrobacteria digunakan sebagai sumber karbon, nitrogen dan energi. Transformasi Hasil dari T-DNA, oleh karena itu, dalam proliferasi sel tanaman yang menghasilkan metabolit digunakan secara istimewa oleh bakteri perangsang; hal itu menyediakan relung ekologis bagi Agrobacterium.
The transfer of the T-DNA to plant cells requires the action of chromosomally encoded genes for the early steps of the transformation process. Nevertheless, most of the functions required for the transfer process itself are encoded by a second region of the Ti plasmid: the virulence (vir) region. This consists of at least eight vir operons that encode 22–27 genes, depending on the strain. The virulence region provides in trans all functions required for the excision of the T-DNA from its Ti plasmid context and its transfer to plant cells. Indeed, the T-DNA itself does not carry genes responsible for its transfer. The only elements essential for the mobility of the T-DNA are two 25-base pair (bp) direct repeats, called border sequences, that delimit the T-DNA. The fact that no cis-acting genes are required forT-DNAtransfer renders Agrobacterium a very attractive tool for plant transformation. Any DNA cloned in the T-DNA between the two borders is efficiently transferred, in a sequence nonspecific manner, to suscep- tible plants.
Transfer T-DNA ke sel tanaman membutuhkan aksi gen kromosom dikodekan untuk langkah awal dari proses transformasi. Namun demikian, sebagian besar fungsi yang diperlukan untuk proses transfer itu sendiri dikodekan oleh wilayah kedua dari Ti plasmid: virulensi (vir) wilayah. Ini terdiri dari setidaknya delapan operon vir yang mengkode 22-27 gen, tergantung pada tekanan. Wilayah virulensi menyediakan di trans semua fungsi yang diperlukan untuk eksisi T-DNA dari yang konteks Ti plasmid dan transfer ke sel tanaman. Memang, T-DNA itu sendiri tidak membawa gen yang bertanggung jawab untuk transfer. Satu-satunya unsur penting untuk mobilitas T-DNA dua pasangan 25-base (bp) mengulangi langsung, disebut urutan perbatasan, yang membatasi T-DNA. Fakta bahwa tidak ada cis-acting gen yang diperlukan pengalihan Fort-DNA membuat Agrobacterium alat yang sangat menarik untuk transformasi tanaman. Setiap DNA kloning di T-DNA antara dua perbatasan yang efisien ditransfer, dalam urutan cara spesifik, untuk tanaman rentan.
Originally, susceptible plants were defined as plants on which a defined Agrobacterium strain could induce tumour development. With the use of Agrobacterium as a trans- formation vector the host range can be redefined as the spectrum of organisms for which transformation is possible. Successful transformation has been achieved not only for dicotyledonous plants, the natural hosts, but also for some monocotyledonous plants (to which the agriculturally important cereals such as wheat, maize, rice belong), gymnosperms, the yeast Saccharomyces cerevisiae and fungi. The host range does not only depend on the ability of Agrobacterium to transfer T-DNA. It also depends on the capacity of the transformed cells to accept the T-DNA and to integrate it into its genome (the transformation competence of the plant material). Finally the host range depends on the capacity of the transformed cells to regenerate into fertile transgenic plants. This regeneration competence of the plant material is in many cases the limiting step.
Awalnya, tanaman rentan didefinisikan sebagai tanaman yang satu Agrobacterium galur didefinisikan bisa menginduksi perkembangan tumor. Dengan menggunakan Agrobacterium sebagai vektor transformasi kisaran host dapat didefinisikan ulang sebagai spektrum organisme yang transformasi mungkin. Transformasi sukses telah dicapai tidak hanya untuk tanaman dikotil, tuan rumah alami, tetapi juga untuk beberapa tanaman monokotil (yang sereal pertanian penting seperti gandum, jagung, beras milik), gymnosperma, Saccharomyces cerevisiae ragi dan jamur. Kisaran host tidak hanya tergantung pada kemampuan Agrobacterium mentransfer T-DNA. Hal ini juga tergantung pada kapasitas sel berubah untuk menerima T-DNA dan untuk mengintegrasikan ke dalam genom (kompetensi transformasi bahan tanaman). Akhirnya kisaran inang tergantung pada kapasitas sel berubah untuk beregenerasi menjadi tanaman transgenik yang subur. Ini kompetensi regenerasi bahan tanaman dalam banyak kasus langkah membatasi.
b. Transfer of the T-DNA to plant nuclei
The initiation of Agrobacterium-mediated transformation requires wounded plant cells, targets for agrobacteria (Figure 2, step 1). In the process of wound healing plant cells release precursors for cell wall regeneration. These are sensed by Agrobacterium, leading to transcription of the genes of the virulence region (Figure 2, step 2). The products of these genes initiate T-DNA transfer. Two proteins, VirD2 and VirE2, play a key role. The VirD2 protein recognizes and cleaves the T-DNA at its border sequences (Figure 2, step 3). Concomitantly VirD2 becomes covalently attached to the 5’ end of the T-DNA, leading to the release of a single-stranded T-DNA molecule. The VirE2 protein is the most abundant protein synthesized by induced agrobacteria. It can bind to single-stranded DNA in a sequence-unspecific and cooperative manner, coating the entire T-DNA. The VirD2–single-stranded T-DNA complex and VirE2 proteins are exported to the plant cells where they probably meet to form the T-complex. The export is mediated by a transfer apparatus that delivers the different components to plant cells (Figure 2, step 4). Once inside the plant cell, the T-complex has to be targeted to the plant nucleus and has to enter it (Figure 2, step 5). Nuclear import of the T-complex through the nuclear pore complex is mediated by its protein components VirD2 and VirE2. Thus, in analogy to virus particles, Agrobacterium equips its transfer complex with specificities to gain access to the nucleus. This step represents an important advantage of Agrobacterium-mediated gene transfer over other transgenesis methods.
b. Transfer T-DNA untuk menanam inti
Inisiasi transformasi Agrobacterium-dimediasi membutuhkan sel tanaman yang terluka, target untuk agrobacteria (Gambar 2, langkah 1). Dalam proses luka sel tumbuhan penyembuhan melepaskan prekursor untuk regenerasi dinding sel. Ini dirasakan oleh Agrobacterium, yang mengarah ke transkripsi gen dari wilayah virulensi (Gambar 2, langkah 2). Produk dari gen ini melakukan transfer T-DNA. Dua protein, VirD2 dan VirE2, memainkan peran kunci. The VirD2 protein mengakui dan memotong T-DNA pada urutan perbatasan (Gambar 2, langkah 3). Bersamaan VirD2 menjadi kovalen melekat pada ujung 5 'dari T-DNA, yang mengarah ke rilis molekul T-DNA untai tunggal. The VirE2 protein adalah protein yang paling berlimpah disintesis oleh agrobacteria diinduksi. Hal ini dapat mengikat DNA untai tunggal dengan cara urutan-tidak spesifik dan koperasi, lapisan seluruh T-DNA. The VirD2-untai tunggal kompleks T-DNA dan protein VirE2 diekspor ke sel tanaman di mana mereka mungkin bertemu untuk membentuk T-kompleks. Ekspor dimediasi oleh aparat perpindahan yang memberikan berbagai komponen sel tanaman (Gambar 2, langkah 4). Setelah di dalam sel tanaman, T-kompleks harus ditargetkan untuk inti tanaman dan harus memasukkannya (Gambar 2, langkah 5). Impor nuklir dari T-kompleks melalui kompleks pori nuklir dimediasi oleh komponen protein yang VirD2 dan VirE2. Dengan demikian, dalam analogi partikel virus, Agrobacterium melengkapi kompleks transfer dengan kekhususan untuk mendapatkan akses ke inti. Langkah ini merupakan keuntungan penting dari transfer gen Agrobacterium-dimediasi atas metode transgenesis lainnya.
c. Integration of the T-DNA
The T-DNA enters the plant cell nucleus, where it integrates into the plant genome (Figure 2, step 6). This integration step occurs randomly with respect to the chromosomal insertion site, predominantly into actively transcribed regions, by a process involving plant enzymes. One of the characteristics of the Agrobacterium- mediated gene transfer is that up to 50% of the transformed cells contain a single copy of the transgenes. This could be due to the fact that only a few T-DNA complexes are transferred to plant cells. In addition, the transfer of the T-DNAas a nucleoprotein complex protects the T-DNA until its integration into the plant genome.
c.Integrasi T-DNA
T-DNA memasuki inti sel tanaman, di mana hal tersebut terintegrasi ke dalam genom tanaman (Gambar 2, langkah 6). Langkah integrasi ini terjadi secara acak terhadap situs kromosom penyisipan, terutama ke daerah aktif ditranskripsi, dengan proses yang melibatkan enzim tanaman. Salah satu karakteristik dari Agrobacterium- dimediasi transfer gen adalah bahwa hingga 50% dari sel-sel berubah mengandung satu salinan dari transgen. Hal ini bisa disebabkan oleh fakta bahwa hanya beberapa kompleks T-DNA yang ditransfer ke sel tanaman. Selain itu, transfer T-DNA sebagai kompleks nukleoprotein melindungi T-DNA sampai integrasinya ke dalam genom tanaman.
Indeed, in about half of the cases, the 5’ end of the T-DNA is preserved to the nucleotide to which the VirD2 protein is attached. The VirE2 protein affords complete protection of theT-DNAover its length and only a few nucleotides of the left border are lost. Thus almost complete T-DNA molecules are integrated into the plant genome. This is in clear contrast to the integration of transgenes following the use of other transgenesis methods.
Memang, di sekitar setengah dari kasus, ujung 5 'dari T-DNA yang diawetkan dengan nukleotida yang protein VirD2 terpasang. The VirE2 protein yang memberikan perlindungan lengkap Thet-DNA lebih panjang dan hanya beberapa nukleotida dari perbatasan kiri hilang. Molekul T-DNA sehingga hampir selesai diintegrasikan ke dalam genom tanaman. Hal ini berbeda jelas untuk integrasi transgen mengikuti penggunaan metode transgenesis lainnya.
Post a Comment