Elements / essential component needed in DNA cloning are:
(a) Restriction enzymes (DNA cutting enzyme)
(b) Cloning vector (carrier)
(c) Ligase enzyme that serves to connect the DNA chain, and other enzymes such as alkaline phosphatase, DNA polymerase, reverse transcriptase, polynucleotide kinase, and others whose use is required in accordance with the objectives of a particular procedure.
Basic processes in DNA cloning include:
1) Cutting DNA (DNA organism under study and DNA vectors)
2) Grafting pieces (fragments) DNA of organisms with DNA vector using ligase enzymes.
3) Transformation of recombinant DNA (vector + DNA inserts) into bacterial cells
4) Selection (screening) to obtain the desired DNA clones.
Unsur-unsur/ komponen yang esensial diperlukan dalam kloning DNA adalah :
(a) Enzim restriksi (enzim pemotong DNA)
(b) Kloning vektor (pembawa)
(c) Enzim ligase yang berfungsi menyambung rantai DNA, dan enzim-enzim lain seperti alkalin fosfatase, DNA polimerase, reverse transkriptase, polinukleotida kinase, dan lainnya yang penggunaannya diperlukan sesuai tujuan-tujuan prosedur tertentu.
Proses-proses dasar dalam kloning DNA meliputi :
1) Pemotongan DNA (DNA organisme yang diteliti dan DNA vektor)
2) Penyambungan potongan-potongan (fragmen) DNA organisme dengan DNA vektor menggunakan enzim ligase.
3) Transformasi rekombinan DNA (vektor + DNA sisipan) ke dalam sel bakteri
4) Seleksi (screening) untuk mendapatkan klon DNA yang diinginkan.
B. Restriction Enzyme
B. Enzim Restriksi
Restriction endonucleases (also called restriction enzymes) are some of the most powerful tools in molecular biology. Cutting DNA by using restriction enzymes is one of the most common molecular biology techniques and the availability of pure restriction enzymes was one of the first major advances in the new science of Molecular Biology. These enzymes occur naturally in bacteria and are used to protect the bacteria from invading foreign DNA such as bacterial viruses (bacteriophage). Restriction enzymes recognize specific sequences in DNA and then cleave the phosphodiester bonds between the nucleotides at that site. Any time this sequence appears in DNA it will be cleaved by the enzyme, whether it is viral or frog or human DNA. This is why restriction enzymes are so critical to molecular biology; they are very specific, cutting only at their unique recognition sequence, but they are also general because they will cut any DNA having this sequence. They work by cutting the DNA at a specific nucleotide sequence, the recognition sequence of the enzyme. The result is the generation of DNA fragments (restriction fragments) from a DNA molecule having these recognition sequences or cut sites. Thus, digestion of a population of identical DNA molecules with a given enzyme will always result in identical restriction fragments. This is called an enzyme digestion and has made cloning and other DNA manipulations possible. Restriction enzymes (abbreviated RE) usually recognize palindromic sequences in DNA (See Figure 4.2.1). For example, the widely used restriction enzyme BamHI recognizes the sequence GAATTC. This is considered a palindrome because the complementary strand will have the identical sequence in the opposite direction.
Endonuklease restriksi (juga disebut enzim restriksi) adalah beberapa alat yang paling kuat dalam biologi molekuler. Pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi merupakan salah satu teknik biologi molekuler yang paling umum dan ketersediaan enzim restriksi murni adalah salah satu kemajuan besar pertama dalam ilmu baru Biologi Molekuler. Enzim ini terjadi secara alami pada bakteri dan digunakan untuk melindungi bakteri dari menyerang DNA asing seperti virus bakteri (bakteriofag). Enzim restriksi mengenali urutan tertentu di DNA dan kemudian membelah ikatan fosfodiester antara nukleotida di situs tersebut. Setiap kali urutan ini muncul dalam DNA itu akan dibelah oleh enzim, apakah itu virus atau katak atau DNA manusia. Inilah sebabnya mengapa enzim restriksi begitu penting untuk biologi molekuler; mereka sangat spesifik, pemotongan hanya pada urutan pengakuan mereka yang unik, tetapi mereka juga umumnya karena mereka akan memotong setiap DNA memiliki urutan ini. Mereka bekerja dengan memotong DNA pada urutan nukleotida spesifik, urutan pengakuan enzim. Hasilnya adalah generasi fragmen DNA (fragmen restriksi) dari molekul DNA memiliki urutan pengakuan ini atau situs dipotong. Dengan demikian, pencernaan populasi molekul DNA yang identik dengan enzim tertentu akan selalu menghasilkan fragmen restriksi yang sama. Ini disebut enzim pencernaan dan telah membuat kloning dan manipulasi DNA lain yang mungkin. Enzim restriksi (disingkat RE) biasanya mengenali urutan palindromic dalam DNA (Lihat Gambar 4.2.1). Sebagai contoh, enzim restriksi BamHI banyak digunakan mengakui GAATTC urutan. Ini dianggap palindrom karena untai komplementer akan memiliki urutan identik dalam arah yang berlawanan.
1. Blunt and Sticky Ends
A given enzyme will always cut between the same two nucleotides. As shown in Figure 4.2.1, some enzymes cut in the center of the recognition sequence, which results in the formation of “blunt ends” in DNA. Most restriction enzymes make cuts one or two bases away from the axis of symmetry, which results in the formation of single-stranded ends two or four base pairs long on the end of each fragment. Because these ends are complementary, they are referred to as “cohesive” or “sticky ends”. Since a given restriction enzyme produces identical ends in any DNA molecule, restriction fragments from one source can be recombined with DNA from other sources if they are both cut with the same enzyme. This characteristic allows the formation of recombinant DNA molecules and is the basis of most DNA cloning protocols. Typically, sticky ends are preferred for recombinant DNA work although blunt ends can be attached to other blunt ends when necessary (it is harder to join them together later).
Sebuah enzim yang diberikan akan selalu dipotong antara dua sama nukleotida. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4.2.1, beberapa enzim memotong di tengah urutan pengakuan, yang menghasilkan pembentukan "ujung tumpul" di DNA. Kebanyakan enzim restriksi membuat pemotongan satu atau dua basis jauh dari sumbu simetri, yang menghasilkan pembentukan untai tunggal berakhir dua atau empat pasangan basa panjang di akhir setiap fragmen. Karena tujuan ini saling melengkapi, mereka disebut sebagai "kohesif" atau "ujung lengket". Karena enzim restriksi tertentu menghasilkan ujung identik dalam setiap molekul DNA, fragmen restriksi dari satu sumber dapat digabungkan dengan DNA dari sumber lain jika mereka berdua dipotong dengan enzim yang sama. Karakteristik ini memungkinkan pembentukan molekul DNA rekombinan dan merupakan dasar dari yang paling protokol kloning DNA. Biasanya, ujung lengket lebih disukai untuk pekerjaan DNA rekombinan meskipun ujung tumpul dapat dilampirkan ke ujung tumpul lainnya bila diperlukan (lebih sulit untuk bergabung dengan mereka bersama-sama nanti).
Post a Comment