ISOLATION, IDENTIFICATION, MULTIFICATION

Tags:
 Isolation

Isolation of DNA and begins with the destruction or disposal of the cell wall, which can be done either by mechanical means such as sonication, high pressure, beku¬leleh or by enzymatic means such as lysozyme administration. The next step is cell lysis. Material-¬bahan relatively soft cells can easily be resuspended in buffer medium nonosmotik, while the more rugged bahan¬bahan need to be treated with a strong detergent such as triton X¬ 100 or with sodium dodecyl sulfate (SDS).In eukaryotes these measures should be accompanied by the destruction of the nuclear membrane. After the cells undergo lysis, remukan¬remukan cell should be discarded. Usually disposal cell crumbled done by centrifugation. The remaining proteins precipitated using an organic solvent such as phenol or chloroform and then centrifuged and destroyed enzymatically with proteinase. DNA that has been cleared of proteins and crushed cells still mixed with RNA that need to be added RNase to clean up DNA from RNA. DNA molecule which has been isolated is then purifiedwith the addition of ammonium acetate and the alcohol or by using CsCl density centrifugation.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku¬leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-¬bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan¬bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X¬ 100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan¬remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikandengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

DNA isolation techniques can be applied, both for genomic DNA as well as DNA vectors, particularly plasmids. To choose between the two kinds of DNA molecules to be isolated can be used two approaches. First, the plasmid in general are in a very strong tertiary structure or said to have a covalently closed circular (CCC), whereas chromosomal DNA is much looser ties both strand and have a very high axial ratio. That difference causes the plasmid DNA is much more resistant to denaturation when compared with the chromosomal DNA. Therefore, the application will be able to separate the denaturing conditions of plasmid DNA with the DNA of chromosomes.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

DNA molecules in a cell can be extracted or isolated for various purposes such as amplification and analysis of DNA by electrophoresis. DNA isolation is done with the intention to separate the DNA from other materials such as proteins, fats, and carbohydrates. The main principle in the isolation of DNA, there are three namely the destruction (lysis), DNA extraction or separation of solid materials such as cellulose and proteins, as well as DNA purification (Corkill and Rapley, 2008; Dolphin, 2008). According Surzycki (2000), there are some things that need to be considered in the process of DNA isolation, among others, have to produce DNA in the absence of contaminants such as proteins and RNA; methods should be effective and can be done for all species methods do may not alter the molecular structure and function of DNA; and the method should be simple and quick.

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

DNA isolation principle in various types of cells or tissues in a variety of organisms are basically the same but has a modification in terms of techniques and materials used. Even some of the techniques become easier by using a kit manufactured by a company as an example of a kit that is used for the isolation of DNA in plants such as Kit nucleon Phytopure while for the isolation of DNA in animals used GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. However, DNA isolation stages in each step has its own protocol adapted to the needs. The use of DNA isolation techniques with the kit and manual has advantages and disadvantages. The conventional method has the advantages of cheaper prices and are widely used while shortcomings requires a relatively long time and the results obtained depending on the type of sample.

Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.

The first stage in DNA isolation is the process of destruction or the destruction of the membrane and cell wall. Cell solution (lysis) is a stage of initial DNA isolation which aims to remove the cell contents (Holme and Hazel, 1998). Phase destruction of cells or tissues have several ways to get a physical way as to grind the samples using a mortar and pestle in liquid nitrogen or by using the method of freezing-thawing and irradiation (Giacomazzi et al., 2005). Another way is by using chemical or enzymatic. Destruction by using a chemical such as the use of detergents which can dissolve the lipids in cell membranes, causing destabilization of cell membranes (Surzycki, 2000). While the enzymatic method such as using proteinase K as to lyse the cell membranes in the blood (Khosravinia et al., 2007) as well as degrade the globular protein or polypeptide chain in the component cells (Brown, 2010; Surzycki (2000).

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).

DNA molecules in a cell can be extracted or isolated for various purposes such as amplification and analysis of DNA by electrophoresis. DNA isolation is done with the intention to separate the DNA from other materials such as proteins, fats, and carbohydrates. The main principle in the isolation of DNA, there are three namely the destruction (lysis), DNA extraction or separation of solid materials such as cellulose and proteins, as well as DNA purification (Corkill and Rapley, 2008; Dolphin, 2008). According Surzycki (2000), there are some things that need to be considered in the process of DNA isolation, among others, have to produce DNA in the absence of contaminants such as proteins and RNA; methods should be effective and can be done for all species methods do may not alter the molecular structure and function of DNA; and the method should be simple and quick.

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

In the process of using the detergent lysis, often used sodium dodecyl sulphate (SDS) as pelisisan stage of the cell membrane. The detergent in addition to a role in lysing the cell membrane can also play a role in reducing nuclease enzyme activity that is degrading enzyme DNA (Switzer, 1999). In addition to use SDS, other detergents such as cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) is also often used to lyse the cell membranes in the plant DNA isolation (Bettelheim and Landesberg, 2007). The success in the use of CTAB depends on several things. First, the concentration of NaCl should be above 1.0 M to prevent the formation of CTAB-DNA complexes. Because the amount of water in the cell pellets are difficult to predict, then the use of CTAB as the solver must with NaCl solution with a concentration of at least 1.4 M. Secondly, extracts and cells containing CTAB solution should be stored at room temperature for CTAB-DNA complex bersifatinsolublepada temperatures below 15 ° C , Third, the use of CTAB with good purity will determine the purity of DNA obtained and with very little contamination polysaccharides. Once added CTAB, samples incubated at room temperature. This incubation goal is to prevent the precipitation of CTAB as CTAB will precipitate at a temperature of 15 ° C. Because of its effectiveness in removing polysaccharides, CTAB is widely used for purification of DNA in cells contains many polysaccharides such as found in plant cell and gram-negative bacteria such as Pseudomonas, Agrobacterium and Rhizobium (Surzycki, 2000).

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000).

In the use of CTAB buffer reagents are often added such as NaCl, EDTA, Tris-HCl, and 2-mercaptoethanol. NaCl is used to remove polysaccharides while 2-mercaptoethanol befungsi to remove the content of polyphenol compounds in plant cells (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol can eliminate polyphenols in plant cells by forming hydrogen bonds with the polyphenol compounds are then separated the DNA (Lodhi et al., 1994). Polyphenol compounds need to be removed in order to obtain good quality DNA (Moyo et al., 2008). Polyphenols also can inhibit the reaction of the enzyme Taq polymerase at the time of amplification. Besides, polyphenols would reduce the yield of DNA extraction and reduce the level of purity of DNA (Porebskiet al., 1997). The use of 2-mercaptoethanol with heating can also denature proteins contaminating DNA (Walker and Rapley, 2008).

Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).

Concentration and pH of the buffers that are used should be in the range of pH 5 to 12. The solution was buffered with a low pH will cause depurifikasi and the resulting DNA distributed to phenol phase during deproteinization process. While the high pH above 12 will result in the separation of double-stranded DNA. The function of buffer solution is to maintain the structure of DNA during the process of destruction and purification so as to facilitate in removing the protein and RNA and prevents DNA degrading enzyme activity and prevent changes in the DNA molecule. To optimize the function of a buffer solution, it takes concentration, pH, ionic strength, and the addition of DNAase inhibitors and detergents (Surzycki 2000).

Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000).

At the stage of extraction of DNA, often used chelating agents such as ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), which acts inactivate the enzyme DNase that can denature the DNA is isolated, EDTA inactivates the enzyme nuclease by binding magnesium and calcium ions are required as cofactor enzyme DNAse (Corkill and Rapley, 2008). DNA was extracted from the cells then need to be separated from contaminant components of other cells such as polysaccharides and proteins that DNA obtained has a high purity. Phenol is often used as Denaturing protein, using phenol extraction causes the protein to lose its solubility and undergo further precipitation can be separated from the DNA by centrifugation (Karp, 2008). Bettelheim and Landesberg (2007) states that after centrifugation will form two separate phases the organic phase on the bottom layer and aquoeus phase (water) on the top layer, while DNA and RNA will be at aquoeus phase after centrifugation while denatured protein will be at the interphase and lipids will be in the organic phase (Figure 1). In addition to phenol, can also be used a mixture of phenol and chloroform or a mixture of phenol, chloroform, and isoamyl alcohol to denature the protein. DNA extract obtained is often too contaminated by RNA so that the RNA can be separated from the DNA extracts by way of RNase (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).

Post a Comment

Artikel Terkait Tips Motivasi